Produccion de Acido citrico por Hongos
1.-Biosíntesis del Acido Cítrico
El ácido cítrico (ácido 2 hidroxipropano-1,2,3 tricarboxílico) es un producto metabólico primario y se forma en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La glucosa es la principal fuente de carbono utilizada para la producción de este ácido. En muchos microorganismos el 80% de la glucosa utilizada para esta biosíntesis se metaboliza por reacciones de la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) y 20 % por reacciones del ciclo de la pentosa fosfato. Durante la fase de crecimiento la relación entre estas dos vías es de 2:1. Cuando el piruvato es descarboxilado con formación de acetil-CoA, el residuo de acetato se canaliza hacia el ciclo de los ácidos tricarboxílicos..
La actividad de la citrato sintasa (enzima condensante) aumenta por un factor 10 durante la producción del ácido cítrico, mientras las actividades de las enzimas que catabolizan ácido cítrico, como la aconitasa y la isocitrato deshidrogenasa, se reducen drásticamente en comparación con su actividad durante la trofofase
La citrato sintasa no puede ser solamente responsable del mantenimiento de la actividad del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, ya que el ciclo se detendría si el ácido cítrico fuera removido. Por lo tanto deben existir durante la fase de producción distintas secuencias que rellenan los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (secuencias anapleróticas)
2.-Cepas Utilizadas
Muchas cepas excretan trazas de ácido cítrico como producto del metabolismo primario. Como ejemplos están Aspergillus niger, A. wentii, A. clavatus, Penicillium luteum, P. citrinum, Mucor piriformis, Paecelomyces divaricatum, Candida guillermondii, Saccharomycopsis lipolytica, Trichoderma viridae,
Sin embargo, para la producción comercial sólo se utilizan mutantes de A. niger. Comparado con las cepas de Penicillium, los aspergillus producen más ácido cítrico por unidad de tiempo. Además la formación de productos laterales no deseados, como ácido oxálico, ácido isocítrico y ácido glucónico puede ser más fácilmente suprimida en estos mutantes.
3.-Sistemas de Fermentación
El ácido cítrico puede ser producido tanto en procesos de superficie como sumergidos. Varios factores afectan la elección del tipo de proceso: la existencia de capital de inversión, la abundancia de energía, el costo, el entrenamiento de la mano de obra, la existencia de técnicas para la medida y la regulación.
3.1 Procesos en Superficie
En este sistema se utilizan bandejas de acero inoxidable, o aluminio de alta pureza, de 1-2m2 de superficie y 5-10cm de altura, que se cargan con el medio de cultivo y se siembran con conidios de Aspergillus. Al cabo de 2-5 días la superficie está cubierta con una capa de micelio. Con esto, se verifica una adecuada velocidad de producción de ácido cítrico, y la fermentación se completa en 7 a 8 días.
3.2 Procesos Sumergidos
El 80% de la producción mundial de ácido cítrico se hace mediante procesos sumergidos. Aunque dura más días que los otros métodos presenta varias ventajas: menor inversión en la construcción y menor inversión total, es necesaria menos mano de obra. También presenta algunas desventajas respecto de los métodos anteriores: mayor costo de energía, la tecnología de control es más sofisticada, con lo que se requiere un personal más especializado, la formación de espuma también es un problema en la producción de ácido cítrico, pero se soluciona por la adición de antiespumantes. En resumen, el rendimiento es mayor en la producción sumergida. Existen 3 factores especialmente importantes para los procesos sumergidos: La calidad del material para construir el fermentador: El fermentador debe estar protegido de la acción de los ácidos o bien ser de acero inoxidable, porque de no ser así, cuando se alcancen valores de pH de 1 ó 2, se liberarán metales de las paredes del fermentador, que podrán inhibir la formación de ácido cítrico
4.- Condiciones que Afectan la Fermentación del Proceso
4.1. Constituyentes del Medio
· Fuente de Carbohidrato:
Como fuente de carbohidratos pueden ser utilizados una serie de materias primas tales como almidón de papa, hidrolizados de almidón, jarabe de glucosa de almidón sacarificado, sacarosa de diferentes niveles de pureza, jarabe de caña de azúcar con dos tercios de la sacarosa convertida en azúcar invertido, melazas de caña de azúcar y de remolacha.
· Fuente de Nitrógeno:
En los medios sintéticos se agregan sales nitrogenadas, generalmente NO3NH4 (0.15-0.25%).Es importante que la fuente de N sea escasa respecto a la de C, para limitar el desarrollo del hongo. Si la concentración de N es elevada se forma mucho micelio y poco ácido cítrico; en cambio, si está en cantidad limitada, el hongo se desarrolla mientras lo dispone.
· Sales nutritivas:
En medios sintéticos se agregan pequeñas concentraciones de PO4H2K (0.03-0.3%) y SO4Mg (0.05-0.1%), para proporcionar al hongo elementos indispensables para su desarrollo. Emplenado cantidades mayores aumenta la formación de ácido oxálico y disminuye el rendimiento en ácido cítrico
· Elementos trazas
El cobre, manganeso, magnesio, hierro, zinc y molibdeno son necesarios para el crecimiento óptimo en el rango de las ppm. Sin embargo, un exceso respecto de las concentraciones óptimas puede tener un efecto tóxico
4.2. Condiciones Ambientales
- pH: El empleo de pH bajo favorece la producción de ácido cítrico, suprime la de oxálico, reduce al mínimo el peligro de contaminaciones y facilita la esterilización. El intervalo de pH más satisfactorio es de 1 a 2%.
- Temperatura: La temperatura óptima para las cepas productoras de ácido cítrico se encuentra entre 25°C y 35°C.
- Aireación: La formación de ácido cítrico es un fenómeno de oxidación y por lo tanto, el oxígeno no debe faltar nunca. Para cultivos de superficie, la circulación de aire saturado de humedad debe ser de 200 ml de aire por hora y por gramo de micelio. Para procesos a micelio sumergido, la cuba se airea con oxígeno o aire a presión (presión en la cuba, 2 a 3 atm), regulando la velocidad del agitador de manera de disolver más de 100mg de O2 por litro y por minuto.
6.- Recuperación del Producto
Si se llega a formar ácido oxálico como producto lateral debido a un bajo control de la fermentación, se precipita como oxalato de calcio a pH bajo, dejando el ácido cítrico en la solución como citrato monocálcico. Se utilizan filtros rotatorios o centrífugas para separar el micelio y el precipitado de oxalato cálcico del líquido. A pH 7,2 y 70-90 ºC, precipita el ácido cítrico, lo que permite a su vez que sea separado mediante filtros rotatorios y secado. Para algunos usos especiales, el ácido cítrico es purificado por adición de ácido sulfúrico para disolver el ácido cítrico, formándose un precipitado de sulfato cálcico. Las etapas subsiguientes de recuperación incluyen el tratamiento con carbón activado, cambiadores de iones y la cristalización como ácido cítrico o ácido cítrico monohidratado. Por encima de 40ºC el ácido cítrico cristaliza como ácido anhidro y por debajo de 36,5ºC como monohidrato. La pureza requerida del producto depende del uso para el que se prepare. Cuando se destina a la industria de los alimentos debe ser más puro que el que se necesita para usos industriales.
El ácido cítrico (ácido 2 hidroxipropano-1,2,3 tricarboxílico) es un producto metabólico primario y se forma en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La glucosa es la principal fuente de carbono utilizada para la producción de este ácido. En muchos microorganismos el 80% de la glucosa utilizada para esta biosíntesis se metaboliza por reacciones de la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) y 20 % por reacciones del ciclo de la pentosa fosfato. Durante la fase de crecimiento la relación entre estas dos vías es de 2:1. Cuando el piruvato es descarboxilado con formación de acetil-CoA, el residuo de acetato se canaliza hacia el ciclo de los ácidos tricarboxílicos..
La actividad de la citrato sintasa (enzima condensante) aumenta por un factor 10 durante la producción del ácido cítrico, mientras las actividades de las enzimas que catabolizan ácido cítrico, como la aconitasa y la isocitrato deshidrogenasa, se reducen drásticamente en comparación con su actividad durante la trofofase
La citrato sintasa no puede ser solamente responsable del mantenimiento de la actividad del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, ya que el ciclo se detendría si el ácido cítrico fuera removido. Por lo tanto deben existir durante la fase de producción distintas secuencias que rellenan los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (secuencias anapleróticas)
2.-Cepas Utilizadas
Muchas cepas excretan trazas de ácido cítrico como producto del metabolismo primario. Como ejemplos están Aspergillus niger, A. wentii, A. clavatus, Penicillium luteum, P. citrinum, Mucor piriformis, Paecelomyces divaricatum, Candida guillermondii, Saccharomycopsis lipolytica, Trichoderma viridae,
Sin embargo, para la producción comercial sólo se utilizan mutantes de A. niger. Comparado con las cepas de Penicillium, los aspergillus producen más ácido cítrico por unidad de tiempo. Además la formación de productos laterales no deseados, como ácido oxálico, ácido isocítrico y ácido glucónico puede ser más fácilmente suprimida en estos mutantes.
3.-Sistemas de Fermentación
El ácido cítrico puede ser producido tanto en procesos de superficie como sumergidos. Varios factores afectan la elección del tipo de proceso: la existencia de capital de inversión, la abundancia de energía, el costo, el entrenamiento de la mano de obra, la existencia de técnicas para la medida y la regulación.
3.1 Procesos en Superficie
En este sistema se utilizan bandejas de acero inoxidable, o aluminio de alta pureza, de 1-2m2 de superficie y 5-10cm de altura, que se cargan con el medio de cultivo y se siembran con conidios de Aspergillus. Al cabo de 2-5 días la superficie está cubierta con una capa de micelio. Con esto, se verifica una adecuada velocidad de producción de ácido cítrico, y la fermentación se completa en 7 a 8 días.
3.2 Procesos Sumergidos
El 80% de la producción mundial de ácido cítrico se hace mediante procesos sumergidos. Aunque dura más días que los otros métodos presenta varias ventajas: menor inversión en la construcción y menor inversión total, es necesaria menos mano de obra. También presenta algunas desventajas respecto de los métodos anteriores: mayor costo de energía, la tecnología de control es más sofisticada, con lo que se requiere un personal más especializado, la formación de espuma también es un problema en la producción de ácido cítrico, pero se soluciona por la adición de antiespumantes. En resumen, el rendimiento es mayor en la producción sumergida. Existen 3 factores especialmente importantes para los procesos sumergidos: La calidad del material para construir el fermentador: El fermentador debe estar protegido de la acción de los ácidos o bien ser de acero inoxidable, porque de no ser así, cuando se alcancen valores de pH de 1 ó 2, se liberarán metales de las paredes del fermentador, que podrán inhibir la formación de ácido cítrico
4.- Condiciones que Afectan la Fermentación del Proceso
4.1. Constituyentes del Medio
· Fuente de Carbohidrato:
Como fuente de carbohidratos pueden ser utilizados una serie de materias primas tales como almidón de papa, hidrolizados de almidón, jarabe de glucosa de almidón sacarificado, sacarosa de diferentes niveles de pureza, jarabe de caña de azúcar con dos tercios de la sacarosa convertida en azúcar invertido, melazas de caña de azúcar y de remolacha.
· Fuente de Nitrógeno:
En los medios sintéticos se agregan sales nitrogenadas, generalmente NO3NH4 (0.15-0.25%).Es importante que la fuente de N sea escasa respecto a la de C, para limitar el desarrollo del hongo. Si la concentración de N es elevada se forma mucho micelio y poco ácido cítrico; en cambio, si está en cantidad limitada, el hongo se desarrolla mientras lo dispone.
· Sales nutritivas:
En medios sintéticos se agregan pequeñas concentraciones de PO4H2K (0.03-0.3%) y SO4Mg (0.05-0.1%), para proporcionar al hongo elementos indispensables para su desarrollo. Emplenado cantidades mayores aumenta la formación de ácido oxálico y disminuye el rendimiento en ácido cítrico
· Elementos trazas
El cobre, manganeso, magnesio, hierro, zinc y molibdeno son necesarios para el crecimiento óptimo en el rango de las ppm. Sin embargo, un exceso respecto de las concentraciones óptimas puede tener un efecto tóxico
4.2. Condiciones Ambientales
- pH: El empleo de pH bajo favorece la producción de ácido cítrico, suprime la de oxálico, reduce al mínimo el peligro de contaminaciones y facilita la esterilización. El intervalo de pH más satisfactorio es de 1 a 2%.
- Temperatura: La temperatura óptima para las cepas productoras de ácido cítrico se encuentra entre 25°C y 35°C.
- Aireación: La formación de ácido cítrico es un fenómeno de oxidación y por lo tanto, el oxígeno no debe faltar nunca. Para cultivos de superficie, la circulación de aire saturado de humedad debe ser de 200 ml de aire por hora y por gramo de micelio. Para procesos a micelio sumergido, la cuba se airea con oxígeno o aire a presión (presión en la cuba, 2 a 3 atm), regulando la velocidad del agitador de manera de disolver más de 100mg de O2 por litro y por minuto.
6.- Recuperación del Producto
Si se llega a formar ácido oxálico como producto lateral debido a un bajo control de la fermentación, se precipita como oxalato de calcio a pH bajo, dejando el ácido cítrico en la solución como citrato monocálcico. Se utilizan filtros rotatorios o centrífugas para separar el micelio y el precipitado de oxalato cálcico del líquido. A pH 7,2 y 70-90 ºC, precipita el ácido cítrico, lo que permite a su vez que sea separado mediante filtros rotatorios y secado. Para algunos usos especiales, el ácido cítrico es purificado por adición de ácido sulfúrico para disolver el ácido cítrico, formándose un precipitado de sulfato cálcico. Las etapas subsiguientes de recuperación incluyen el tratamiento con carbón activado, cambiadores de iones y la cristalización como ácido cítrico o ácido cítrico monohidratado. Por encima de 40ºC el ácido cítrico cristaliza como ácido anhidro y por debajo de 36,5ºC como monohidrato. La pureza requerida del producto depende del uso para el que se prepare. Cuando se destina a la industria de los alimentos debe ser más puro que el que se necesita para usos industriales.
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